单层培养的细胞系在进行原代培养时，随着培养时间的延长和细胞的不断分裂，一则细胞之间相互接触而发生接触抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面由于营养物质消耗殆尽、代谢废弃物不断积累，导致细胞停止生长甚至死亡。此时，为获得大量的、稳定的同种细胞，并保证细胞始终维持快速生长，可以将单层细胞从培养基质上分离下来制成单细胞悬液，按照*浓度接种到若干个新的培养器皿内继续培养，这个过程就称为传代（Passage）或再培养（Subculture）。

 

单层细胞传代培养，需要将细胞间及细胞与培养基质之间的连接打断。对于某一些松散贴壁的细胞类型，只需轻敲培养器皿侧面，细胞就会脱离下来。绝大多数贴壁细胞需要使用蛋白水解酶例如，trypsin/EDTA消化破坏上述连接。还有少数细胞需要使用机械力，例如使用细胞刮，使细胞分离下来。对单层培养而言，细胞生长接近指数生*末时（大约70%-90%汇合），即可进行传代。一般生长稳定的细胞4~7天传代一次。

 

单层培养传代步骤：

 

1. 事先将培养基、Trypsin-EDTA溶液、Trypsin中和液、DPBS在室温平衡，并准备若干已包被好poly-L-lysine或Fibronectin等的培养器皿。

 

注：不*使用37℃水浴锅对上述溶液进行平衡。

 

2. 将长满细胞的培养器皿中原有培养液吸弃，DPBS洗涤细胞1-2次。

 

3. 加入适量（略盖过细胞即可）Trypsin-EDTA溶液室温孵育0.5-2 min，不定时在显微镜下观察细胞状态，直至约80%细胞收缩、变圆突起（round up），立即加入等体积Trypsin中和液终止消化。

 

注：不同类型细胞消化时间长短不一，佳消化时间需自行摸索。

 

4. 轻轻晃动培养容器使细胞脱离，并将消化下来的细胞收集、转移到离心管内。另取适量*培养基润洗培养容器，将残留的细胞一并转移至离心管。

 

注：细胞收集完毕后，可以在显微镜下观察培养容器内还有多少细胞残留（通常应少于5%），以此判断细胞收获是否*。 

 

5. 将收获的细胞悬液于1000rpm下离心5min，弃上清，然后用适量*培养基重悬细胞。

 

6. 计数细胞，然后根据*的接种密度重新接种到新的已包被好的培养皿内。将培养器皿置于37℃, 5% CO2/95% air培养箱培养，视细胞生长情况，每隔2-3天换一次液，详见datasheet。

 

注：有限细胞系的增殖速率较低，其原代培养通常以1:1，1:2或1:3的比例进行传代，但是对于增殖速率很高的连续细胞系（或无限细胞系），通常要以更高的比例进行传代。